مونکی پوکس وائرس ریئل ٹائم پی سی آر کٹ
پروڈکٹ کی تفصیلات
مطلوبہ استعمال
یہ ریئل ٹائم پی سی آر سسٹمز کا استعمال کرتے ہوئے انسانی سیرم یا زخموں کے اخراج کے نمونوں میں مونکی پوکس وائرس کا پتہ لگانے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔
ٹیسٹ کا اصول
یہ پروڈکٹ فلوروسینٹ پروب پر مبنی Taqman® ریئل ٹائم PCR پرکھ کا نظام ہے۔مخصوص پرائمر اور پروبس کو مونکی پوکس وائرس کے F3L جین کا پتہ لگانے کے لیے ڈیزائن کیا گیا ہے۔انسانی محفوظ شدہ جین کو نشانہ بنانے والا اندرونی کنٹرول نمونے کے جمع کرنے، نمونے کی ہینڈلنگ اور ریئل ٹائم پی سی آر کے عمل کی نگرانی کرتا ہے تاکہ غلط-منفی نتائج سے بچا جا سکے۔یہ کٹ مکمل طور پر پریمکس لائو فلائزڈ سسٹم ہے، جس میں مونکی پوکس وائرس کا پتہ لگانے کے لیے درکار مواد شامل ہیں: نیوکلک ایسڈ ایمپلیفیکیشن انزائم، یو ڈی جی انزائم، ری ایکشن بفر، مخصوص پرائمر اور پروب۔
اہم مشمولات
فراہم کردہ اجزاء ٹیبل میں درج ہیں۔
| اجزاء | پیکج | اجزاء |
| مونکی پوکس وائرسلائوفیلائزڈ پریمکس | 8 پٹی پی سی آر ٹیوبیں۔× 6 پاؤچ | پرائمر، تحقیقات، dNTP/dUTP مکس، Mg2+، Taq DNA پولیمریز، UDG انزائم |
| MPV مثبت کنٹرول | 400 μL × 1 ٹیوب | ڈی این اے کی ترتیب جس میں ٹارگٹ جین ہوتا ہے۔ |
| MPV منفی کنٹرول | 400 μL × 1 ٹیوب | انسانی جین کے حصے پر مشتمل ڈی این اے کی ترتیب |
| حل کرنے والا حل | 1 ایم ایل × 1 ٹیوب | سٹیبلائزر |
| مطابقت کا سرٹیفکیٹ | 1 ٹکڑا | / |
آپریشن فلو
1. نمونہمجموعہ:نمونہ کے مطابق جراثیم سے پاک ٹیوبوں میں جمع کیا جانا چاہئے۔
معیاری تکنیکی خصوصیات کے ساتھ۔
2. ریجنٹ کی تیاری (ریجنٹ کی تیاری کا علاقہ)
کٹ کے اجزاء کو باہر نکالیں، اسٹینڈ بائی استعمال کے لیے کمرے کے درجہ حرارت پر توازن رکھیں۔
3. نمونہ پروسیسنگ (نمونہ پروسیسنگ ایریا)
3.1 نیوکلک ایسڈ نکالنا
وائرل DNA نکالنے کی کٹس کی متعلقہ ضروریات اور طریقہ کار کے مطابق نیوکلک ایسڈ نکالنے کے لیے 200μL مائع کے نمونے، مثبت کنٹرول اور منفی کنٹرول لینے کی سفارش کی جاتی ہے۔
3.2 Lyophilized پاؤڈر تحلیل اور ٹیمپلیٹ اضافہ
نمونوں کی تعداد کے مطابق Monkeypox Virus Lyophilized premix تیار کریں۔ایک نمونے کے لیے ایک پی سی آر ٹیوب کی ضرورت ہے جس میں لائو فلائزڈ پریمکس پاؤڈر ہو۔منفی کنٹرول اور مثبت کنٹرول کو دو نمونوں کے طور پر سمجھا جانا چاہئے۔
(1) Lyophilized premix پر مشتمل ہر PCR ٹیوب میں 15μL تحلیل کرنے والا محلول شامل کریں، پھر ہر PCR ٹیوب میں بالترتیب 5μL نکالے گئے نمونے/منفی کنٹرول/مثبت کنٹرول شامل کریں۔
(2) پی سی آر ٹیوبوں کو مضبوطی سے ڈھانپیں، پی سی آر ٹیوبوں کو ہاتھ سے اس وقت تک ہلائیں جب تک کہ لائو فلائزڈ پاؤڈر مکمل طور پر تحلیل اور بلینڈ نہ ہوجائے، فوری طور پر کم رفتار سینٹری فیوگریشن کے ذریعے مائع کو پی سی آر ٹیوبوں کے نیچے تک جمع کریں۔
(3) اگر پتہ لگانے کے لیے عام ریئل ٹائم پی سی آر آلہ استعمال کریں، تو پی سی آر ٹیوبوں کو براہ راست ایمپلیفیکیشن ایریا میں منتقل کریں۔اگر پتہ لگانے کے لیے BTK-8 استعمال کریں، تو درج ذیل آپریشنز کرنے کی ضرورت ہے: PCR ٹیوب سے BTK-8 کے ری ایکشن چپ کنویں میں 10 μL مائع منتقل کریں۔ایک پی سی آر ٹیوب چپ پر ایک کنویں کے مساوی ہے۔پائپٹنگ آپریشن کے دوران، یقینی بنائیں کہ پائپیٹ 90 ڈگری عمودی ہے۔ایروسول بیریئر پِیٹ ٹِپس کو کنویں کے بیچ میں اعتدال پسند قوت کے ساتھ رکھا جانا چاہیے اور جب یہ پہلے گیئر پر پہنچ جائے (بلبلوں سے بچنے کے لیے) پِیٹ کو دھکیلنا بند کر دیں۔کنویں بھرنے کے بعد، تمام کنوؤں کو ڈھانپنے کے لیے ایک ری ایکشن چپ جھلی نکالیں اور پھر چپ کو ایمپلیفیکیشن ڈیٹیکشن ایریا میں منتقل کر دیا جاتا ہے۔
4. پی سی آر ایمپلیفیکیشن (ڈیٹیکشن ایریا)
4.1 پی سی آر ٹیوبز/ری ایکشن چپ کو ری ایکشن ٹینک میں ڈالیں اور ہر رد عمل کے نام کو اسی ترتیب میں اچھی طرح سے سیٹ کریں۔
4.2 فلوروسینس کا پتہ لگانے کی ترتیبات: (1) مونکی پوکس وائرس (FAM)؛(2) اندرونی کنٹرول (CY5)۔
4.3 درج ذیل سائیکلنگ پروٹوکول کو چلائیں۔
ABI7500، Bio-Rad CFX96، SLAN-96S، QuantStudio کا پروٹوکول:
| قدم | درجہ حرارت | وقت | سائیکل | |
| 1 | پری ڈینیچریشن | 95℃ | 2 منٹ | 1 |
| 2 | ڈینیچریشن | 95℃ | 10 سیکنڈ | 45 |
| اینیلنگ، توسیع، فلوروسینس حصول | 60℃ | 30 سیکنڈ | ||
BTK-8 کا پروٹوکول:
| قدم | درجہ حرارت | وقت | سائیکل | |
| 1 | پری ڈینیچریشن | 95℃ | 2 منٹ | 1 |
| 2 | ڈینیچریشن | 95℃ | 5 سیکنڈ | 45 |
| اینیلنگ، توسیع، فلوروسینس حصول | 60℃ | 14 سیکنڈ | ||
5. نتائج کا تجزیہ (براہ کرم انسٹرومنٹ یوزر مینوئل سے رجوع کریں)
ردعمل کے بعد، نتائج خود بخود محفوظ ہو جائیں گے۔تجزیہ کرنے کے لیے "تجزیہ کریں" پر کلک کریں، اور آلہ نتیجہ کے کالم میں ہر نمونے کی Ct قدروں کی خود بخود تشریح کرے گا۔منفی اور مثبت کنٹرول کے نتائج درج ذیل "6. کوالٹی کنٹرول" کے مطابق ہوں گے۔
6. کوالٹی کنٹرول
6.1 منفی کنٹرول: FAM چینل میں Ct یا Ct>40 نہیں، CY5 چینل میں Ct≤40 نارمل ایمپلیفیکیشن کرو کے ساتھ۔
6.2 مثبت کنٹرول: عام امپلیفیکیشن وکر کے ساتھ FAM چینل میں Ct≤35، CY5 چینل میں عام ایمپلیفیکیشن وکر کے ساتھ Ct≤40۔
6.3 نتیجہ درست ہے اگر مندرجہ بالا تمام معیارات پورے کیے جائیں۔دوسری صورت میں، نتیجہ غلط ہے.
نتیجہ کی تشریح
درج ذیل نتائج ممکن ہیں:
| FAM چینل کی Ct ویلیو | CY5 چینل کی Ct قدر | تشریح | |
| 1# | کوئی Ct یا Ct> 40 نہیں۔ | ≤40 | مونکی پوکس وائرس منفی |
| 2# | ≤40 | کوئی بھی نتائج | Monkeypox وائرس مثبت |
| 3# | 40-45 | ≤40 | دوبارہ ٹیسٹ؛اگر یہ اب بھی 40~45 ہے تو 1# کے طور پر رپورٹ کریں |
| 4# | کوئی Ct یا Ct> 40 نہیں۔ | کوئی Ct یا Ct> 40 نہیں۔ | غلط |
نوٹ: اگر غلط نتیجہ آتا ہے تو نمونے کو جمع کرنے اور دوبارہ جانچنے کی ضرورت ہے۔
آرڈر کی معلومات
| پروڈکٹ کا نام | کیٹ.نہیں | سائز | نمونہ | شیلف زندگی | ٹرانس& Sto.درجہ حرارت |
| مونکی پوکس وائرس ریئل ٹائم پی سی آر کٹ | B001P-01 | 48 ٹیسٹ/کِٹ | سیرم / لیزن ایکسوڈیٹ | 12 ماہ | -25～-15℃ |
